制粒是常用的飼料加工工藝，通過制粒改善飼料適口性，提高飼料利用率，保證動(dòng)物均衡采食營養(yǎng)素和提高生長速度，同時(shí)在壓制過程中實(shí)現(xiàn)高溫殺菌。在制粒過程中，通常會(huì)通入一定壓汽，從而使粉料在進(jìn)入環(huán)模制粒前達(dá)到較高的溫度，即調(diào)質(zhì)過程。粉料溫度的測定點(diǎn)一般緊靠在調(diào)質(zhì)器的出口處，這里測定的溫度也就是通常所說的制粒溫度，理想的制粒溫度范圍在80-90℃。而實(shí)際使用的蒸汽溫度則遠(yuǎn)高于此，濕蒸汽、飽和蒸汽和過熱蒸汽的溫度分別可以達(dá)到100、140和160℃，同時(shí)粉料通過制粒機(jī)環(huán)模后溫度也會(huì)因摩擦力而增加。此外，蒸汽調(diào)質(zhì)時(shí)的高濕環(huán)境增強(qiáng)了熱能的傳遞。這些都對(duì)飼料中的熱敏性因子，如植酸酶產(chǎn)生極大的破壞。

       制粒對(duì)植酸酶的破壞源于高溫對(duì)其空間結(jié)構(gòu)的破壞，目前飼料上應(yīng)用的植酸酶大部分屬于酸性磷酸酶家族，其空間上包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，因植酸酶的菌種來源不同，其包含的α、β結(jié)構(gòu)數(shù)量不一，如無花果曲霉植酸酶的結(jié)構(gòu)是由一個(gè)較大的α、β結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小的α結(jié)構(gòu)域組成，α、β結(jié)構(gòu)域是由5個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊構(gòu)成，α結(jié)構(gòu)域是由4個(gè)α螺旋組成。而大腸桿菌植酸酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域一個(gè)是由5個(gè)α螺旋和2個(gè)β折疊組成，另一個(gè)是由6個(gè)α螺旋和9個(gè)β折疊組成。植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性，其間的氨基酸被修飾或突變后都會(huì)導(dǎo)致酶活性的喪失，但高溫的影響則在于去折疊效應(yīng)。

        植酸酶目前已通過基因工程微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模廉價(jià)生產(chǎn)，而今，生物工程技術(shù)也為解決植酸酶的熱穩(wěn)定性提供了很好的途徑。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，一些分子能通過化學(xué)修飾有效提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。此外，新型包被技術(shù)和包被材料的應(yīng)用進(jìn)一步提高了植酸酶熱穩(wěn)定性。

        1、生物工程技術(shù)設(shè)計(jì)制造耐熱植酸酶菌株

        自然界產(chǎn)生植酸酶的微生物多種多樣，每種植酸酶的性質(zhì)各不相同，自然界中存在的煙曲霉、淀粉液化芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等中分離到的植酸酶都能耐受高溫，但都在37℃時(shí)酶活性極低，缺乏飼用價(jià)值（見表1）。  

       植酸酶的耐熱性是受基因控制且可以遺傳的。隨著基因工程技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)工程法逐漸成為人們研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要手段。目前在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性工程中常用的方法為：推理設(shè)計(jì)、同序概念、雜合酶和定向進(jìn)化。

       推理設(shè)計(jì)主要是把熱穩(wěn)定蛋白與熱不穩(wěn)定蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，分析究竟是哪些氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。對(duì)耐熱與常溫植酸酶蛋白的研究發(fā)現(xiàn)二者分子量的大小、亞基結(jié)構(gòu)、螺旋程度、極性和活性中心都極相似，但耐熱酶蛋白中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和精氨酸含量均高于常溫菌所產(chǎn)植酸酶，而胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷胺酰胺和天門冬氨酸含量顯著低于常溫酶蛋白。這是因?yàn)楦彼峤Y(jié)構(gòu)熵小而易折疊，且一經(jīng)折疊后則需要很高的能量才能解開，從而提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。谷氨酸和精氨酸分別比帶同樣電荷的氨基酸有更大的側(cè)鏈，側(cè)鏈所提供的疏水作用及離子間互相作用能提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。亮氨酸具有較強(qiáng)的疏水性和較大的側(cè)鏈。目前通過基因定向突變，將植酸酶鄰近活性中心的部分氨基酸突變?yōu)楦彼?，已?jīng)成功的提高了植酸酶的熱穩(wěn)定性。由于脯氨酸易形成β折疊，從而使構(gòu)象更穩(wěn)定牢固，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和提高酶熱穩(wěn)定性方面具有不可忽視的作用。

        同序概念是一種半推理的方法，是對(duì)一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較，以一定的標(biāo)準(zhǔn)程序計(jì)算各氨基酸序列，從中選擇對(duì)每個(gè)氨基酸位點(diǎn)最保守的殘基，拼成序列，然后將最后確定的氨基酸序列翻譯成相應(yīng)的堿基序列，最后選用合適的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)這個(gè)“人造的”目的基因進(jìn)行表達(dá)。該方法能減少有害突變，也不需要進(jìn)行高通量的篩選，但設(shè)計(jì)過程難度較大。

        雜合酶技術(shù)是把來自不同酶分子的結(jié)構(gòu)單元如二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)或功能域進(jìn)行組合或交換以產(chǎn)生具有所需要性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體結(jié)構(gòu)，組合出新酶。目前已經(jīng)有技術(shù)將土曲霉來源的植酸酶表面的一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋用黑曲霉植酸酶上相應(yīng)長度的一段序列替換，獲得了酶活性未變而熱穩(wěn)定性提高的新植酸酶。其原理是因?yàn)?alpha;螺旋中氨基酸改變導(dǎo)致疏水作用變化，增加了熱穩(wěn)定性。因?qū)﹄s合的片段相似性要求高，雜合酶技術(shù)主要應(yīng)用于對(duì)同源蛋白的穩(wěn)定性加以改善。

        定向進(jìn)化主要包括多輪隨機(jī)突變和DNA改組技術(shù)。多輪隨機(jī)突變是以目的基因進(jìn)行第一輪隨機(jī)突變，然后篩選出最佳突變子作為下一輪突變的親本，如此循環(huán)下去獲得性狀優(yōu)良的突變體。DNA改組技術(shù)是指DNA分子的體外重組，通過改變單一或多個(gè)基因原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。實(shí)際上是一種分子水平上的定向進(jìn)化，因此，也稱為分子育種。該方法可在短時(shí)間內(nèi)通過重組有效的變異體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，但需要建立有效的試驗(yàn)方法進(jìn)行篩選。

         2、植酸酶分子的化學(xué)修飾

         酶分子的化學(xué)修飾是一種提高酶熱穩(wěn)定性的重要手段。根據(jù)X射線對(duì)植酸酶晶體衍射結(jié)果表明，其分子表面約一半是由疏水氨基酸占據(jù)著。從熱力學(xué)角度看，疏水氨基酸與水分子接觸對(duì)酶熱穩(wěn)定性不利。因?yàn)榉肿又械臍滏I在維持酶的空間構(gòu)象中起著重要的作用，當(dāng)體系中含有大量的自由水時(shí)，就會(huì)破壞酶分子內(nèi)部的氫鍵，使酶分子構(gòu)象容易發(fā)生變化和變性失活。

        金屬離子的添加能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性?？稍诿傅幕钚灾行暮须x子配位體時(shí)，通過離子鍵與其結(jié)合穩(wěn)定酶的構(gòu)象。此外金屬離子還可作為水分子的替代物占據(jù)水的位置，排除自由水對(duì)酶造成的不穩(wěn)定化影響。但金屬離子對(duì)植酸酶的熱穩(wěn)定性的影響比較復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)在甲醇酵母植酸酶液中添加CaCl2，80℃處理20分鐘后，加入10mmol CaCl2的酶液比加入5mmol CaCl2的相對(duì)酶活高約30%。多數(shù)研究認(rèn)為，陰離子的熱穩(wěn)定作用是SO42->Cl- >Br- >NO3-，陽離子是(CH3)4N+>NH4+>K+、Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+。

        多羥基化合物既可通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連結(jié)，也能通過氫鍵有效地與外部水分子相連結(jié)，使酶蛋白分子穩(wěn)定，它包括多羥基醇、糖類等化合物。多羥基醇有乙二醇、甘油、甘露醇、木糖醇、山梨醇等，糖類有麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等。研究糖對(duì)植酸酶熱穩(wěn)定性的影響發(fā)現(xiàn)，加入甘露醇、葡萄糖、海藻糖均能提高植酸酶在高溫下的熱穩(wěn)定性，與不加糖相比，酶活力保留率提高10%左右。有研究發(fā)現(xiàn)在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖漿廢棄液也可以提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。其原因可能是高粱糖漿廢棄液和淀粉阻止了傳熱，對(duì)酶起到了一定的保護(hù)作用。

        3、新型包被技術(shù)和包被材料

        制粒過程中的水分是影響植酸酶熱穩(wěn)定性的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。完全干燥的植酸酶的去折疊溫度為165℃；當(dāng)水分增加到12%時(shí)，去折疊溫度迅速降為95℃；當(dāng)水分增加到16%時(shí)，去折疊溫度降為88℃。而包被技術(shù)則是將包被材料在物質(zhì)表面形成一層堅(jiān)固疏水的薄膜層以提高植酸酶的熱耐受能力。

        包衣材料的選擇很關(guān)鍵，既要求其能耐受高溫高濕，又要在消化道能迅速釋放發(fā)揮作用。植酸酶包衣材料可分為水溶性和脂溶性兩類。選用水溶性包衣劑如纖維素可以保證在消化道中能快速溶解和釋放植酸酶，但其耐濕能力差。而選用脂溶性包衣劑，如脂肪酸鹽則可以更有效地阻止?jié)駸岬膫鬟f，但包衣需經(jīng)脂肪酶的作用才能大量釋放。目前對(duì)包衣材料的選擇需選擇復(fù)合包衣材料，即在脂溶性包衣劑中混合入崩解劑。崩解劑有很強(qiáng)的疏水性，其特點(diǎn)是在一定的pH下能迅速破裂，釋放出其包被物質(zhì)。

        植酸酶包被多數(shù)采用多層包被以提高其熱穩(wěn)定性。植酸酶的載體一般選擇纖維素、碳酸鈣、糊精、淀粉等，經(jīng)混合、擠壓、切割、圓整、低溫干燥和篩分，制成含酶小顆粒。然后再采用流化床噴涂氫化牛油、明膠等物質(zhì)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，植酸酶經(jīng)包被后在干熱的情況下殘存酶活性比原酶提高8.7%，而濕熱的情況下殘存酶活性則提高58.3%。由此可見，采用包被技術(shù)提高植酸酶熱穩(wěn)定性的效果明顯。

         4、植酸酶熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法的研究

         最直接的植酸酶熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)方法是經(jīng)過制粒生產(chǎn)來測定其存留率，此外也可以通過實(shí)驗(yàn)室的模擬試驗(yàn)來評(píng)估。目前，實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)溫度對(duì)植酸酶活性影響的方法主要有三種，即水浴法、干熱法和濕熱法。

        水浴法即通過調(diào)節(jié)水浴鍋中水溫和植酸酶溶液水浴時(shí)間來評(píng)估溫度對(duì)其活性的影響。此方法簡便但因其必需使用植酸酶溶液，其實(shí)是已經(jīng)將酶蛋白直接暴露在高溫和高濕環(huán)境中，所測存留率要低的多。特別是對(duì)采用包被技術(shù)的產(chǎn)品，水浴法評(píng)估的結(jié)果與實(shí)際制粒條件下差異非常大。

         干熱法是將植酸酶在干燥箱里設(shè)定一定的溫度處理一定時(shí)間，測定該溫度下植酸酶活性損失。但由于忽視了水分的作用使得測定值偏高。

         濕熱法在干熱法基礎(chǔ)上加入濕度因子，使其更接近實(shí)際調(diào)質(zhì)和制粒情況。濕熱法需先測定植酸酶樣品中水分含量，然后據(jù)其水分含量均勻添加純化水調(diào)節(jié)待處理樣品水分至16%，再置于恒溫箱中處理一定時(shí)間。

        濕熱法對(duì)有效評(píng)價(jià)制粒過程中植酸酶存留率具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過對(duì)實(shí)際生產(chǎn)制粒和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估的結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，水浴法、干熱法和濕熱法評(píng)估結(jié)果與實(shí)際制粒條件下酶活存留率的相關(guān)系數(shù)分別是r=-0.62、r=0.09、r=0.97，可見，水浴法評(píng)估結(jié)果與實(shí)際檢測結(jié)果相關(guān)性最差而濕熱法能很好地反映實(shí)際制粒過程中酶活變化情況，是一種相對(duì)有效的實(shí)驗(yàn)室植酸酶熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)方法。

        5、結(jié)語

        植酸酶對(duì)降低飼料成本、減少環(huán)境污染和保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。通過深入研究植酸酶蛋白的結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性的關(guān)系，對(duì)熱穩(wěn)定性基因進(jìn)行定位和重組，篩選出有效的耐高溫菌種，同時(shí)綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性工程中的各種方法，以及選擇合適的酶制劑包被工藝和包被材料，降低植酸酶在飼料制粒過程中的損失，擴(kuò)大植酸酶的應(yīng)用范圍，更全面的發(fā)揮植酸酶的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。